Главная / Здоровье / Капиллярный электрофорез 1 / Повышение чувствительности

Повышение чувствительности

Оцените статью

Ацетонитрил не только удаляет белки, но и выполняет следующее:

нейтрализует отрицательные эффекты высокой концентрации ионов;
обеспечивает более эффективный стэкинг для небольших молекул, чем в случае разбавленных буферов;
останавливает ферментные реакции;
допускает большие объемы инжектируемой пробы (до половины объема капилляра).
В результате достигается 20-кратное повышение чувствительности [18]. Для такого вида стэкинга лучше использовать длинный капилляр и сепарационный буфер с высокой ионной силой. Разумеется, его применение ограничивается небольшими анионами, растворимыми в ацетонитриле, и несовместимо с анализом белков.

 

<10 3 е.о.п.

4)
20
10
0
Рис. 2.2в. Пример стэкинга пробы теофиллина (Т) и фенитоина (Р) с помощью ацетонитрила и буфера низкой концентрации.

То же, что на рис. 2.2а, за исключением того, что проба заполняла 4.5 % объема капилляра
T P
lc:
L
5.0 t, мин
Однако многие небольшие пептиды, например энкефалины, ангиотензин и цепи инсулина, могут концентрироваться этим методом. Стэкинг катионных соединений лучше производить в ацетонитриле в отсутствие солей. Два основных фактора, которые нужно учитывать при создании эффекта стэкинга в ацетонитрильных солевых растворах: это — низкая растворимость неорганических ионов в ацетонитриле и низкая электропроводность самого ацетонитрила. В отсутствие солей происходит ограниченный стэкинг вследствие низкой электропроводности ацетонитрила и высокой

напряженности поля. Однако когда добавляются соли, происходит дополнительный стэкинг либо за счет промежуточного изотахофо- реза, или благодаря движению воды с солями, при котором более концентрированный участок ацетонитрила, где могут концентрироваться органические молекулы, остается позади.

Примеры

Пример стэкинга в ацетонитриле и в буферном растворе с низкой концентрацией ионов. Капилляр заполнялся пробой (смесь тео- филлина и фенитоина) на 0.9 % (рис. 2.2а), 22.5 % (рис. 2.2б) или 4.5 % (рис. 2.2в) от объема капилляра. При небольшом объеме инжектированной пробы (0.9 % от объема капилляра) проба растворялась в буферном растворе с 66 % ацетонитрила или смеси 66 % ацетонитрила с NaCl. Это не оказывало заметного влияния на высоту пиков или разделение (рис. 2.2а). Однако когда объем пробы увеличивается до 4.5 % от объема капилляра, начинает

проявляться эффект стэкинга в разбавленном буфере и в ацетонитриле (рис. 2.2в). При дальнейшем увеличении объема пробы до 22.5 % объема капилляра хорошее разделение и большая высота пиков получались только в смеси ацетонитрил—NaCl (рис. 2.2б). В этом случае высота пиков увеличивалась в 20 раз по сравнению с рис. 2.2а. В приведенных примерах стэкинг и высота пиков зависели от ряда факторов, например напряжения, молярности сепараци- онного буфера, рН и т. д.

Метод депротеинации сыворотки и пищевых продуктов ацетонитрилом. 100 мкл сыворотки встряхивали с 200 мкл ацетонитрила в течение 10 с, центрифугировали с ускорением 15 000 g в течение 30 с, и супернатант вводился в капилляр. Для полного удаления белков сыворотки необходимо, чтобы отношение ацетонит- рил/сыворотка (по объему) было по крайней мере 3 : 2 [17].

На практике удобнее использовать более высокое отношение — два

объема ацетонитрила к одному объему сыворотки.

Стэкинг чистых соединений. Такие соединения можно растворять в смеси, содержащей 2 объема ацетонитрила и 1 объем раствора NaCl с концентрацией 150 мМ/л. Избыток компонентов пробы может влиять на ионную силу, в особенности при низкой концентрации буфера, вызывать плохое разделение [19].

elektroforez-6

Рис. 2.2в. Пример стэкинга пробы теофиллина (Т) и фенитоина (Р) с помощью ацетонитрила и буфера низкой концентрации.

То же, что на рис. 2.2а, за исключением того, что проба заполняла 4.5 % объема капилляра

Оставить комментарий

Ваш email не будет опубликован. Поля для обязательного заполнения *

*

Подняться вверх