Главная / Здоровье / Капиллярный электрофорез 1 / СТЭКИНГ И ПОЛЕВАЯ ИНЖЕКЦИЯ

СТЭКИНГ И ПОЛЕВАЯ ИНЖЕКЦИЯ

Оцените статью

Стэкинг — это простой и распространенный метод увеличения концентрации пробы непосредственно в капилляре и повышения чувствительности детектирования в ВЭКЭ. Стэкинг можно реализовать с помощью нескольких простых манипуляций с пробой.

а. Низкая ионная сила пробы. Если приготовить пробу в том же самом электрофоретическом буфере, но с более низкой концентрацией, сопротивление пробы и, следовательно, напряженность поля (В/см) в пределах введенной пробы возрастут. Это заставит ионы быстро мигрировать и концентрироваться в виде резкой полосы на границе между инжектированной пробой и электрофоретическим буфером, при этом положительные ионы выстраиваются впереди отрицательных. Находясь в электрофоретическом буфере, компоненты пробы мигрируют в различных зонах в соответствии с отношением их массы к заряду. В результате этой простой процедуры концентрация пробы может быть увеличена в 10 раз. Это наиболее изученный вид стэкинга. Степень оперативного стэкинга (или концентрирования) пробы пропорциональна отношению концентраций электрофоретического буфера и буфера пробы [12]. Теоретически приготовленные в воде пробы должны давать максимальную степень стэкинга. Однако поскольку электроосмос в разбавленной пробе происходит быстрее, чем в электрофоретическом буфере, расхождение в скоростях электроосмотического течения вызывает ламинарное течение внутри капилляра, что снижает эффективность процесса стэкинга [12, 13]. Кроме того, под действием сильного поля во введенной пробе может выделяться тепло, вызывая расширение полосы [14] и термическое разложение некоторых компонентов [15].

Ряд исследователей использовали различные математические модели для описания стэкинга и расширения полосы. Сила стэкин- га, которая определяется как разность между напряженностями поля в пробе и в буфере, может быть выражена следующим образом [7]:

Эффект стэкинга может использоваться как при инжекции под давлением (рис. 2.1, а), так и при электрокинетической инжекции (инжекции полем). Исходя из приведенной формулы, увеличения числа теоретических тарелок можно достичь, если концентрация буфера с пробой приблизительно в 10 раз ниже концентрации электрофоретического буфера, при этом длина введенной пробы будет в 10 раз больше ширины пика при ограниченном размывании [13]. Если при стэкинге прикладывается низкий потенциал [6, 10], при меньшей концентрации буфера или большей длине пробы в капилляре будет увеличиваться ламинарное течение.

б. Инжекция порции воды. Описан метод стэкинга путем инжекции в капилляр порции воды перед инжекцией пробы [16]. Здесь действует в основном тот же принцип, что и в предыдущем методе.

в. Обратная полярность. Дополнительно увеличить объем пробы для стэкинга можно путем кратковременного изменения полярности сразу после инжекции пробы в разбавленном буферном растворе [16]. Благодаря этому ионы матрицы пробы, которые могут влиять на разделение, удаляются вначале. Контроль за удалением матрицы производится по силе тока, которая выходит на плато после полного удаления ионов матрицы.

г. Регулирование рН. Стэкинг пептидов, основанный на регулировании рН пробы, описан в работе [5]. Для придания пептиду отрицательного заряда авторы растворяли пробу в буфере, рН которого превосходил pI на две единицы (pI — изоэлектрическая точка). При приложении потенциала пептиды вначале мигрируют к аноду, пока не достигают границы электрофоретического буфера, где они концентрируются. После создания градиента рН небольшой длины между пробой и сепарационным буфером пептиды заряжаются положительно и мигрируют к катоду в виде узкой зоны. При использовании этого метода увеличение объема пробы, вводимой в капилляр, приводит к пятикратному увеличению ее концентрации.

д. Органические растворители (ниже до конца разд. II использованы данные и примеры из [17, 18]). При анализе небольших молекул органические растворители, такие как ацетонитрил, этанол и метанол, эффективно удаляют белки и обеспечивают высокую степень стэкинга. Многие соединения, растворенные в ацетонит- рил-водных смесях или смесях других органических растворителей с водой, в присутствии или в отсутствие солей создают большую высоту пиков и большее число теоретических тарелок, чем растворенные в разбавленных буферных растворах [17, 18]. Ацетонитрил (в отсутствие солей) сам по себе вызывает стэкинг благодаря увеличению напряженности поля (рис. 2.2а, 2.2в). Это может быть как при инжекции под давлением, так и при электрокинетической инжекции. С помощью этой методики могут концентрироваться как кислые, так и основные соединения.

е. Ацетонитрил-солевые смеси. Присутствие хлористого натрия в сыворотке в концентрации примерно 150 мМ вместе с ацетонитрилом, используемым для депротеинации, реализует еще один уникальный вид стэкинга пробы даже с еще большим увеличением ее концентрации.

elektroforez-4

 

10
5
<10 3 е.о.п.
1)
5.0 t, мин
0
0.0
Рис. 2.2а. Пример стэкинга пробы теофиллина (Т) и фенитоина (Р) с помощью ацетонитрила и буфера низкой концентрации.Капилляр 50 мкм < 42 см; Е = 185 В/см; Л = 214 нм; 0.9 % капилляра заполнялось пробой. Соединения растворялись: 1) в рабочем боратном буфере (борат 150 мМ, рН 8.5); 2) в боратном буфере 15 мМ; 3) в смеси 66 % ацетонитрила с водой; 4) в 66 % ацетонитриле

Этот стэкинг (как явление) отличается от стэкинга, наблюдаемого в отсутствие солей, и от стэкинга, описанного ранее для водных буферов с низкой ионной силой (рис. 2.2б). Такой стэкинг имеет место в органических растворителях, и ему способствует присутствие в пробе высоких концентраций неорганических ионов (например, NaCl) [17, 18]. Этот метод больше подходит для практической работы, в особенности для проб, полученных из сыворотки или пищевого продукта, чем стэкинг в буферах с низкой ионной силой, и создает более высокие концентрации пробы.

elektroforez-5

Рис. 2.2б. Пример стэкинга пробы теофиллина (Т) и фенитоина (Р) с помощью ацетонитрила и буфера низкой концентрации.

То же, что на рис. 2.2а, за исключением того, что проба заполняла 22.5 % объема капилляра

 

 

Оставить комментарий

Ваш email не будет опубликован. Поля для обязательного заполнения *

*

Подняться вверх