ВЯЗКОСТЬ И ОБЪЕМ ПРОБЫ

Оцените статью

При увеличении вязкости электрофоретического буфера размывание полос уменьшается, что приводит к увеличению числа теоретических тарелок и высоты пиков. Однако исследования показывают, что если повышать вязкость пробы, например, путем добавления глицерина, число теоретических тарелок падает.

В отличие от ВЭЖХ, объем пробы в ВЭКЭ сильно влияет на размывание полос. Кроме того, влияние матрицы пробы более заметно при больших объемах пробы (рис. 2.1). Из-за сравнительно низкой чувствительности детектирования в ВЭКЭ желательно использовать большие объемы пробы для увеличения сигнала. Однако необходимо иметь в виду, что может легко произойти передозировка пробы. Это происходит вследствие принципиальных ограничений, касающихся а) отношения общего объема введенной пробы qs к объему капилляра qc, которое ограничивает максимальное число теоретических тарелок 7Vmax

Число теоретических тарелок в КЭ, помимо всего прочего, сильно зависит от длины (объема,) введенной пробы [7-9]. Согласно работе [8], максимально допустимый инжектируемый объем (W) может быть выражен следующим образом:

W = (24DEtY2, (2.3)

где D — коэффициент диффузии растворенного вещества, Е — допустимое увеличение высоты тарелки (определяемой как длина капилляра, деленная на число теоретических тарелок), t — время экспонирования пробы (с).

При использовании в качестве модельного соединения B-hGH (биосинтетического человеческого гормона роста) с увеличением времени инжекции от 0.2 до 15 с число теоретических тарелок нелинейно падает с 800 000 до менее 10 000, при этом максимальное число теоретических тарелок было получено при приближающемся к нулю объеме пробы [10]. Для получения минимальной высоты тарелки без применения стэкинга ширина полосы должна поддерживаться < 1 мм, что соответствует длине инжектируемой пробы порядка 0.2 % от длины капилляра (до детектора), т. е. 2 нл для капилляра размером 50 мкм я 50 см [9]. Так как на практике на ширину полосы и число теоретических тарелок влияет ряд других факторов, то увеличение объема пробы с 0.2 % до 1 % (5-кратное) от объема капилляра приведет к уменьшению числа теоретических тарелок только приблизительно наполовину. Следовательно, эмпирическое правило состоит в том, чтобы поддерживать инжектируемую длину пробы, особенно в условиях, когда стэкинг не применяется, на уровне менее 1 % от длины капилляра [11-13] (см. следующий раздел II.6). Таким образом, выбор надлежащего объема пробы в КЭ является непростой задачей. Малые объемы пробы обеспечивают очень высокую эффективность (число теоретических тарелок) (рис. 2.1, в, г), однако при этом получаются слабые сигналы детектора. С практической точки зрения при выборе наилучшего времени (объема) инжекции для разделения помогает график зависимости между временем (или объемом) инжекции и высотой пиков. Такой график рекомендуется применять при разработке методик, т. к. он позволяет использовать высоту пика или его площадь для количественных расчетов. В большинстве случаев большая площадь пика обеспечивает более высокую точность и линейность измерения.

Оставить комментарий

Ваш email не будет опубликован. Поля для обязательного заполнения *

*

Подняться вверх