АНТИСЕНС ДНК

Оцените статью

Для разделения нуклеозидов, нуклеотидов и менее крупных молекул ДНК, например одноцепочечных олигонуклеидов длиной менее десяти оснований, хорошо подходят КЗЭ или МЭКХ [136]. Для КЭ-разделения более крупных одноцепочечных ДНК и фрагментов двухцепочечных ДНК в буферной системе необходимо иметь ситовую матрицу, т. е. использовать гель-электрофорез (КГЭ) для разделения молекул ДНК с почти одинаковыми отношениями заряда к массе [137]. Большое внимание привлекли анализ и разделение антисенс-олигодезоксинуклеотидов (-ОДН) коротких фрагментов одноцепочечных олигомеров, обычно содержащих примерно 20 мономерных звеньев, комплементарных к некоторому конкретному гену [138]. Ряд исследователей успешно применяли метод КГЭ либо с линейным полиакриламидом (ПАА) [139, 140], либо с покупными комплектами для КГЭ [136, 138, 141-143] для разделения антисенс-ОДН. Определение антисенс-ОДН и их ката- болитов в биологических жидкостях (плазме и моче) и экстрактах тканей успешно выполнялось с помощью сочетания ВЭЖХ и КГЭ [139]. Общая концентрация антисенс-ОДН определялась методом анионообменной ВЭЖХ, далее одноосновное разделение осуществлялось с помощью КГЭ с использованием 18 % геля ПАА в 30 % (по объему) формамида, содержащего 7 М мочевины и 0.1 М трис- борнокислой-ЭДТК, pH = 8.3. Устойчивость антисенс-ОДН к 3′-экзонуклеазе исследовалась с помощью покупных сменных полимерно-ситовых сред с ПАА в качестве гелевого сита [144].

Сейчас разделение ДНК, в том числе антисенс-ОДН, обычно осуществляется с помощью КГЭ со сшитыми полимерными средами при высоком напряжении (или градиенте напряжения). В отличие от блочного гель-электрофореза, в котором используются два полимера (агароза и акриламид), для КГЭ было предложено большое число разнообразных полимеров [144]: линейный ПАА, гидроксиэтилцеллюлоза (ГЭЦ), гидроксипропилцеллюлоза (ГПЦ), гидроксилпропилметилцеллюлоза (ГПМЦ), полиэтиленоксид (ПЭО), декстран, поливинилпирролидон и полиэтиленгликоль (ПЭГ). Обычно раствор линейного ПАА имеет низкую вязкость при концентрациях ниже 6 %, а для разделения небольших ДНК требуется концентрация выше 10 %. При таких концентрациях раствор линейного ПАА становится довольно вязким, и его трудно заменять особенно в капилляре с внутреннем диаметром ~50 мкм. Было показано, что для разделения небольших олигонуклеотидов (p(dT)n -20) вместо вязкого раствора линейного ПАА эффективнее использовать 30 % раствор декстрана [145]. Описано разделение антисенс-ОДН путем добавления 13 % раствора ПЭГ в 100 мМ трис- боратный буферный раствор, рН = 9.0, содержащий 30 % форма- мида, при 50 °С [146]. Обнаружено, что для разделения олигонуклеотидов методом КГЭ можно использовать мицеллярные жидкокристаллические 18-30 % растворы Pluronic127 (приблизительная молекулярная формула: [полиэтиленоксид]ю6 [полипропилен- оксид]70 [полиэтиленоксид]106) [147, 148]. Растворы Pluronic127 в этом диапазоне концентраций представляют жидкости с достаточно низкой вязкостью (< 2 р). С другой стороны, для ситовых матриц было предложено использовать различные N-замещенные ПАА. Среди них эффективным для снижения вязкости материалом оказался N-акриламиноэтоксиэтил-Р-О-глюкопираноза [144, 149].

Оставить комментарий

Ваш email не будет опубликован. Поля для обязательного заполнения *

*

Подняться вверх