Главная / Здоровье / Капиллярный электрофорез 2 / Краткий обзор методов дериватизации.

Краткий обзор методов дериватизации.

Оцените статью

Большинство анализируемых веществ не флуоресцентны. Каталог Molecular Probes содержит 5000 ссылок по мечению и детектированию нефлуоресцентных молекул [84]. Малый размер капилляров и пробы сильно осложняет реакции дериватизации в ВЭКЭ. Наиболее распространенными агентами дериватизации являются флуороскамин [85, 86], FITC [64, 59, 60, 87], CBQCA [88, 89], OPA [85, 90-92], NDA [93, 94], NBD [95, 96] и FMOC [97]. Разработан ряд конкретных агентов для КЭ: можно назвать 1,2-этанэдитиол для мечения фос- фосерина [98], хлорацетальдегид для аденин-содержащих соединений [99], 1-перинилдиазометан для короткоцепочечных дикарбоксильных кислот [100], 4-метоксин-1,2-фениленэдиамин для ти- розин-содержащих пептидов [101]. Имеется также ряд иммунохимических методик с использованием флуоресцентных антител или антигенов, меченных флуоресцентными агентами [102, 103]. Методы дериватизации можно разделить на выполняемые до разделения и после разделения. Почти все доколоночные схемы деривати- зации требуют больших объемов анализируемого вещества и реагентов, даже если в колонку инжектируется лишь небольшая доля. Однако была выполнена микродериватизация для клетки эритроцита крови человека диаметром 7 мкм и объемом 90 фл, причем для избирательного мечения тиолсодержащих соединений применялся монобромобимам [104]. Когда он проникает сквозь мембрану, клетка превращается в реакционный объем и вместе с содержащимися в ней флуоресцентно-дериватизированными тиолами может инжектироваться в КЭ-колонку. Есть данные об уникальном методе колоночной дериватизации. Инжектировали неповрежденные клетки PC12 в КЭ-колонку; вводили NDA-циановую смесь в реакционный буферный раствор; заставляя клетку лизировать, ждали образования флуоресцентных продуктов и затем включали высокое напряжение для разделения флуоресцентных продуктов в капилляре [105]. Используя соответствующие внутренние стандарты, количественно определяли ряд аминокислот и пептидов, присутствующих в клетках в концентрациях, лежащих в конце атто- мольного диапазона.

Хотя по аппаратной реализации постколоночные методы дери- ватизации сложнее, они имеют такие достоинства, как независимость разделения от химических процессов мечения и лучшее разделение. На рис. 3.8 представлен коаксиальный капиллярный

kapilar-8

Рис. 3.8. Постколоночная дериватизация с использованием капиллярной коаксиальной реакционной камеры [106]

 

реактор, который использовался для ввода о-фталальдегида (OPA) [106]. В системе получены пределы детектирования по концентрации 10-9 М без чрезмерного расширения зон. Альтернативой может быть соединение чрезвычайно малого объема, полученного с использованием выполненных лазером отверстий в разделительном капилляре, и «тройникового» соединения в колонке (рис. 3.9); дериватизационный реагент вводится под действием силы тяжести [92]. К сожалению, многие реакции флуоресцентного мечения протекают медленно, требуют флуоресцентных реагентов и порождают флуоресцентные побочные продукты, так что реальные пределы детектирования анализируемых веществ могут оказаться на много порядков выше значений, предсказываемых только из чувствительности прибора.

Оставить комментарий

Ваш email не будет опубликован. Поля для обязательного заполнения *

*

Подняться вверх