Источник возбуждения

Источники возбуждения делятся на когерентные и некогерентные. Когерентные источники (лазеры) дают узкие линии спектра и возможность фокусировки излучения с получением пучков очень малого диаметра. В табл. 3.1 приведены данные о линиях возбуждения (или диапазоне длин волн) для ряда источников возбуждения. В первом постколоночном детекторе флуоресценции использовались линейный источник излучения и фильтры для разделения длин волн возбуждения и эмиссии [4547]. Внутриколоночная система регистрации флуоресценции с изменяемой длиной волны позволяла осуществлять настройку длины волны во всей УФ-области и имела низкий уровень рассеянного излучения (благодаря использованию двойного монохроматора) при улучшенных пределах детектирования в диапазоне от 0.1 до 1 мкм [47]. Характеристики флуоресцентных систем с широкополосными источниками возбуждения (от дейтериевых, вольфрамовых и дуговых ламп до аргон-ионного лазера с излучением на длине волны 488 нм) сравнивались в работе [48]. Предел детектирования при использовании дуговой ксеноновой лампы для глицина с флуоресцеиновой меткой составлял 3 • 10-7 М. В лазерной системе возбуждения предел детектирования составлял 5 • 10-10 М. Хотя при применении дуговой ксеноновой лампы предел детектирования был

Источники

Диапазон длин волн, нм

 

 

Дейтериевая Ксеноновая Ртутно-ксеноновая Ртутная низкого давления

190-400 (непрерывный) 190-2000 (непрерывный) 190-2000 (непрерывный) 200-550 (линейчатый)

 

Лазеры

Аргон-ионный лазер с воздушным охлаждением	457, 472, 476, 488, 496, 501, 514; выше видимого диапазона: 275, 300, 305, 333, 351, 364
Поликорпусной с удвоением частоты	385, 229, 238, 244, 248, 257; выше видимого диапазона: 350-360, 521, 531, 568
Аргон-криптоновый	647, 752
Г елий-кадмиевый	325,354, 442
Эксимерные: Хлороксеноновый Фторкриптоновый	308 248
Азотный	337
На красителе с накачкой излучением азота	360-950 (перестраиваемый)
Т вердотельные: — ИАГ-лазер (на ит- триево-алюминиевом гранате) с удвоением частоты	532
— ИАГ-лазер с учет-	266
верением частоты — Диодный	620 (инфракрасный)

 

хуже, она позволяла регистрировать собственную флуоресценцию триптофан-содержащих пептидов при использовании УФ- возбуждения. Описан флуоресцентный детектор на основе флуоресцентного микроскопа с эпи-освещением с пределом детектирования для рибофлавина 0.5 мкМ. Характеристики некогерентного источника лучше у флуориметра с фильтром высокой эффективности, ксеноновой дуговой лампой мощностью 75 Вт и кюветой с проточной оболочкой (для уменьшения рассеяния от стенок капилляра). При использовании этой системы пределы детектирования по концентрации для аминокислот с FITC-метками были приблизительно 10 пМ, что соответствовало концентрации 0.2 амоль меченой аминокислоты, инжектированной в колонку [49]. Хотя эта система повышает чувствительность ламповых схем, необходимость использования фильтров для выбора длины волны возбуждения и пропускающей оптики не УФ-диапазона снижает одно из преимуществ широкополосного источника — большую гибкость в выборе длины волны, особенно в ультрафиолетовой области спектра. Лазеры особенно хорошо подходят для фокусировки в узкие капилляры, и их излучение может фокусироваться до пределов, определяемых дифракцией света. Другое достоинство лазера в том, что монохроматический источник возбуждения предполагает узкополосные релеевское и комбинированное рассеяния, кот о- рые легче отфильтровать, чем спектральный фон при использовании дуговых ксеноновых ламп. Мощность лазера легко менять в широком диапазоне и оптимизировать применительно к исследуемой флуоресцентной системе. Высокие мощности используют для более фотостабильных флуорофоров, а низкие мощности — для менее стабильных молекул.