Федерации пауэрлифтинга Черновицкой области Ты — творец своего тела, будь сильным!
Большинство анализируемых веществ не флуоресцентны. Каталог Molecular Probes содержит 5000 ссылок по мечению и детектированию нефлуоресцентных молекул [84]. Малый размер капилляров и пробы сильно осложняет реакции дериватизации в ВЭКЭ. Наиболее распространенными агентами дериватизации являются флуороскамин [85, 86], FITC [64, 59, 60, 87], CBQCA [88, 89], OPA [85, 90-92], NDA [93, 94], NBD [95, 96] и FMOC [97]. Разработан ряд конкретных агентов для КЭ: можно назвать 1,2-этанэдитиол для мечения фос- фосерина [98], хлорацетальдегид для аденин-содержащих соединений [99], 1-перинилдиазометан для короткоцепочечных дикарбоксильных кислот [100], 4-метоксин-1,2-фениленэдиамин для ти- розин-содержащих пептидов [101]. Имеется также ряд иммунохимических методик с использованием флуоресцентных антител или антигенов, меченных флуоресцентными агентами [102, 103]. Методы дериватизации можно разделить на выполняемые до разделения и после разделения. Почти все доколоночные схемы деривати- зации требуют больших объемов анализируемого вещества и реагентов, даже если в колонку инжектируется лишь небольшая доля. Однако была выполнена микродериватизация для клетки эритроцита крови человека диаметром 7 мкм и объемом 90 фл, причем для избирательного мечения тиолсодержащих соединений применялся монобромобимам [104]. Когда он проникает сквозь мембрану, клетка превращается в реакционный объем и вместе с содержащимися в ней флуоресцентно-дериватизированными тиолами может инжектироваться в КЭ-колонку. Есть данные об уникальном методе колоночной дериватизации. Инжектировали неповрежденные клетки PC12 в КЭ-колонку; вводили NDA-циановую смесь в реакционный буферный раствор; заставляя клетку лизировать, ждали образования флуоресцентных продуктов и затем включали высокое напряжение для разделения флуоресцентных продуктов в капилляре [105]. Используя соответствующие внутренние стандарты, количественно определяли ряд аминокислот и пептидов, присутствующих в клетках в концентрациях, лежащих в конце атто- мольного диапазона.
Хотя по аппаратной реализации постколоночные методы дери- ватизации сложнее, они имеют такие достоинства, как независимость разделения от химических процессов мечения и лучшее разделение. На рис. 3.8 представлен коаксиальный капиллярный
Рис. 3.8. Постколоночная дериватизация с использованием капиллярной коаксиальной реакционной камеры [106]
реактор, который использовался для ввода о-фталальдегида (OPA) [106]. В системе получены пределы детектирования по концентрации 10-9 М без чрезмерного расширения зон. Альтернативой может быть соединение чрезвычайно малого объема, полученного с использованием выполненных лазером отверстий в разделительном капилляре, и «тройникового» соединения в колонке (рис. 3.9); дериватизационный реагент вводится под действием силы тяжести [92]. К сожалению, многие реакции флуоресцентного мечения протекают медленно, требуют флуоресцентных реагентов и порождают флуоресцентные побочные продукты, так что реальные пределы детектирования анализируемых веществ могут оказаться на много порядков выше значений, предсказываемых только из чувствительности прибора.
