Пределы детектирования для многокапиллярной оптической системы должны быть на пикомольном уровне, чтобы система была достаточно чувствительной для прямого анализа стандартных реакций секвенирования ауторадиографического уровня (где времена экспозиции составляют многие часы) с применением КЭ-ЛИФ. Кроме того, оптическая система должна обеспечивать возможность контроля по крайней мере четырех разных спектральных областей для реализации распространенных «4-цветных» протоколов секвенирования [75, 76]. Наконец, для разработки успешной оптической системы для многокапиллярного КЭ с ЛИФ-детектированием нужно иметь эффективное и экономичное средство облучения множества капилляров. Многокапиллярная система КЭ-ЛИФ была применена для секвенирования и классификации ДНК [66, 77]. Эта система основана
Рис. 3.7. Оптические методы реализации многокапиллярной системы КЭ-ЛИФ
на конфокальном сканирующем флуоресцентном анализаторе с возбуждением аргон-ионным лазером (рис. 3.7, г). Плоская матрица капилляров перемещается на координатном столике под неподвижным объективом микроскопа и каждый из капилляров «окрашивается» в эпи-осветительном режиме. В этом режиме луч лазера возбуждения фокусируется тем же объективом со 180° геометрией, после чего осуществляется конфокальное детектирование с использованием ФЭУ. Пределы детектирования для флуоресцеи- на лежат в пикомольном диапазоне. При емкости магазина 200 капилляров, круглосуточной работе и воспроизводимом разрешении геля до 500 оснований за время разделения 2 часа эта система была способна обеспечить скорость секвенирования примерно 1.2 миллиона оснований в день. В микрокапиллярном КЭ-ЛИФ можно использовать регистрацию флуоресценции с осевым лазерным лучом возбуждения [78, 79]. В этом методе (рис. 3.7, б) луч аргонового лазера поступал на один из концов волоконно-оптического жгута из 10 оптических волокон, другие концы оптических волокон вставлялись в выходные концы капилляров, расположенные в один ряд под охлаждаемой системой ПЗС-фотокамеры. Описано плоскостное освещение магазина со 100 капиллярами [80]. Два выходных пучка (488 и 514 нм для анализа семейства из 4 флуорофоров) аргон-ионного лазера направлялись на магазин капилляров с помощью цилиндрических линз, и флуоресцентное излучение регистрировалось ПЗС-камерой (рис. 3.7, а). Пределы детектирования по концентрации для флуоресцеина 10-9-10-10 М. Усовершенствованная система для одновременного облучения и регистрации флуоресцентного излучения от 4000 капилляров выполняет первичное секвенирование со скоростью 3 млрд оснований в течение 35 дней [80]. При боковом облучении линейного магазина лазерный луч возбуждения (большего диаметра, чем внутренний диаметр капилляров) направляется через боковую сторону магазина капилляров (рис. 3.7, в) [81]. Для подавления рассеяния и перекрестных помех магазин капилляров погружали в воду так, чтобы область окошка была в воде, что обеспечивало хорошее согласование показателей преломления. Другой подход к многокапиллярному КЭ-ЛИФ заключался в использовании многокапиллярной системы с проточной оболочкой [82, 83]. В этом случае (рис. 3.7, д) магазин капилляров заканчивается оптической ячейкой, через которую пропускаются пучки возбуждения (Л = 488 нм от аргон-ионного лазера и 532 нм от ИАГ-лазера с удвоением частоты) в режиме бокового облучения. Флуоресцентное излучение регистрируется с использованием оптических фильтров, светоделительной призмы и охлаждаемой ПЗС-камеры, соединенной с охлаждаемым усилителем изображения. Для 20-капиллярной системы пределы детектирования 10-13 М для ДНК, меченных техасским красным в одноцветовом режиме, и 10-12 М для ДНК, меченных люминофором семейства
4 люминофоров в 4-цветном режиме регистрации.