Главная / Здоровье / Капиллярный электрофорез 2 / Многокапиллярные подходы

Многокапиллярные подходы

Оцените статью

Пределы детектирования для многокапиллярной оптической системы должны быть на пикомольном уровне, чтобы система была достаточно чувствительной для прямого анализа стандартных реакций секвенирования ауторадиографического уровня (где времена экспозиции составляют многие часы) с применением КЭ-ЛИФ. Кроме того, оптическая система должна обеспечивать возможность контроля по крайней мере четырех разных спектральных областей для реализации распространенных «4-цветных» протоколов секвенирования [75, 76]. Наконец, для разработки успешной оптической системы для многокапиллярного КЭ с ЛИФ-детектированием нужно иметь эффективное и экономичное средство облучения множества капилляров. Многокапиллярная система КЭ-ЛИФ была применена для секвенирования и классификации ДНК [66, 77]. Эта система основана

kapilar-7

Рис. 3.7. Оптические методы реализации многокапиллярной системы КЭ-ЛИФ

на конфокальном сканирующем флуоресцентном анализаторе с возбуждением аргон-ионным лазером (рис. 3.7, г). Плоская матрица капилляров перемещается на координатном столике под неподвижным объективом микроскопа и каждый из капилляров «окрашивается» в эпи-осветительном режиме. В этом режиме луч лазера возбуждения фокусируется тем же объективом со 180° геометрией, после чего осуществляется конфокальное детектирование с использованием ФЭУ. Пределы детектирования для флуоресцеи- на лежат в пикомольном диапазоне. При емкости магазина 200 капилляров, круглосуточной работе и воспроизводимом разрешении геля до 500 оснований за время разделения 2 часа эта система была способна обеспечить скорость секвенирования примерно 1.2 миллиона оснований в день. В микрокапиллярном КЭ-ЛИФ можно использовать регистрацию флуоресценции с осевым лазерным лучом возбуждения [78, 79]. В этом методе (рис. 3.7, б) луч аргонового лазера поступал на один из концов волоконно-оптического жгута из 10 оптических волокон, другие концы оптических волокон вставлялись в выходные концы капилляров, расположенные в один ряд под охлаждаемой системой ПЗС-фотокамеры. Описано плоскостное освещение магазина со 100 капиллярами [80]. Два выходных пучка (488 и 514 нм для анализа семейства из 4 флуорофоров) аргон-ионного лазера направлялись на магазин капилляров с помощью цилиндрических линз, и флуоресцентное излучение регистрировалось ПЗС-камерой (рис. 3.7, а). Пределы детектирования по концентрации для флуоресцеина 10-9-10-10 М. Усовершенствованная система для одновременного облучения и регистрации флуоресцентного излучения от 4000 капилляров выполняет первичное секвенирование со скоростью 3 млрд оснований в течение 35 дней [80]. При боковом облучении линейного магазина лазерный луч возбуждения (большего диаметра, чем внутренний диаметр капилляров) направляется через боковую сторону магазина капилляров (рис. 3.7, в) [81]. Для подавления рассеяния и перекрестных помех магазин капилляров погружали в воду так, чтобы область окошка была в воде, что обеспечивало хорошее согласование показателей преломления. Другой подход к многокапиллярному КЭ-ЛИФ заключался в использовании многокапиллярной системы с проточной оболочкой [82, 83]. В этом случае (рис. 3.7, д) магазин капилляров заканчивается оптической ячейкой, через которую пропускаются пучки возбуждения (Л = 488 нм от аргон-ионного лазера и 532 нм от ИАГ-лазера с удвоением частоты) в режиме бокового облучения. Флуоресцентное излучение регистрируется с использованием оптических фильтров, светоделительной призмы и охлаждаемой ПЗС-камеры, соединенной с охлаждаемым усилителем изображения. Для 20-капиллярной системы пределы детектирования 10-13 М для ДНК, меченных техасским красным в одноцветовом режиме, и 10-12 М для ДНК, меченных люминофором семейства

4 люминофоров в 4-цветном режиме регистрации.

Оставить комментарий

Ваш email не будет опубликован. Поля для обязательного заполнения *

*

Подняться вверх